皮膚淀粉樣變是一種臨床常見(jiàn)的皮膚疾病，病因尚未明確，特征性表現(xiàn)為皮膚真皮乳頭部位淀粉樣蛋白沉積，可伴劇烈瘙癢，目前對(duì)于皮膚淀粉樣變?yōu)楹慰梢鸹颊唣W的機(jī)制研究幾乎為空白。關(guān)于 TＲPV1 在皮膚淀粉樣變中的作用研究尚無(wú)報(bào)道，本文研究 TＲPV1 在皮膚淀粉樣變皮損中的表達(dá)，并以正常皮膚作為對(duì)照，以探討其在疾病中的意義，并為瘙癢的發(fā)病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
1. 1 對(duì)象 臨床及病理確診的皮膚淀粉樣變患者 22例均來(lái)自 2012 年 3 月 － 2015 年 3 月本科門診，年齡25 ～ 82 歲，平均( 38. 2 ± 16. 2) 歲，男 12 例，女 10 例，病程 6 個(gè)月 ～ 30 年。3 個(gè)月內(nèi)未使用皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑類藥物; 對(duì)照組 16 例健康志愿者的皮膚組織，正常對(duì)照組與患者性別、年齡匹配。所有患者均簽署知情同意書后，取軀干或四肢皮膚淀粉樣變皮損標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，普通 HE 染色病理檢查確診并做免疫組化檢查; 其中 12 例患者皮損的一半標(biāo)本和 10例正常對(duì)照皮膚的一半標(biāo)本先放入液氮快速致冷后再凍存于-70℃?zhèn)溆谩１狙芯客ㄟ^(guò)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫
理委員會(huì)審批，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。
1. 2 材料 兔抗人 TＲPV1 多 克 隆 抗 體 購(gòu) 自 美 國(guó)Chimicon 公司，即用型 SP 試劑盒和 AEC 顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司，引物由北京賽百勝生物有限公司合成，cDNA 合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。
1. 3 從皮膚組織提取總 ＲNA，合成 cDNA 皮膚標(biāo)本置液氮中，用錘子砸碎或用研缽研碎皮膚組織，100mg 組織加入 lm L Trizol 試劑; 用 Trizol 液分別從已粉碎的皮膚組織中提取總 ＲNA，按 Trizol 試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司) 說(shuō)明操作。
1. 4 半定量 ＲT-PCＲ 檢測(cè) 引物序列如下: 內(nèi) 參GAPDH 上游引物: 5 ’- GAG TCC ACT GGC GTC TTCAC -3’，下游引物: 5’- GTT CAC ACC CAT GAC GAACA -3 ’，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 120bp; 反 應(yīng) 條 件: 94℃ 預(yù) 變 性5min，94℃ 45 s，60 ℃ 45s，72℃ 1 min，共 30 個(gè)循環(huán)，最后延伸 72 ℃ 10min; TＲPV1 上游引物: 5’-CTGCTG CTG GCC TAT GTA ATT CT -3 ’，下游引物: 5 ’-TTC TCC GTG TCC AGG ATG GT -3 ’，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物145bp。反應(yīng)條件: 94℃ 預(yù)變性 5min，94℃ 45 s，62℃45s，72℃ 1 min，共 35 個(gè) 循 環(huán)，最 后 延 伸 72 ℃10min。不加引物或模板的擴(kuò)增體系作為陰性對(duì)照，PCＲ 產(chǎn)物以 2% 瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析 DNA 熒光強(qiáng)度值，TＲPV1 的 PCＲ產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度與 GAPDH 信號(hào)強(qiáng)度校正后，再計(jì)算靶基因 mＲNA 表達(dá)強(qiáng)度升高或降低的百分比。
1. 5 免疫組化檢測(cè)靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá) 連續(xù)切取4μm 石蠟切片，二甲苯脫蠟 2 次，PBS 洗，TＲPV1抗體4℃ 過(guò)夜，采用即用型 SP 試劑盒，AEC 顯色試劑盒進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè) TＲPV1 蛋白表達(dá)。結(jié)果判定: 顯微鏡下觀察并留取相片，以角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿及胞膜染成紅色顆粒為陽(yáng)性。應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)，對(duì)切片著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，獲得平均光密度值( OD) 。所有組織切片與免疫組化結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法評(píng)估。
1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤( x ± s) 表示，兩組均數(shù)之間的比較用 Sutdent's t 檢 驗(yàn)，P ＜ 0. 05 為 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué)意義。
2. 1 半定量 ＲT-PCＲ 檢測(cè) 見(jiàn)圖 1。用 ＲT-PCＲ 對(duì) 12例臨床及病理組織檢查確診的皮膚淀粉樣變皮損和10 例正常對(duì)照皮膚組織進(jìn)行了 TＲPV1 的 mＲNA 半定量檢測(cè)，結(jié)果顯示皮膚淀粉樣變皮損中 TＲPV1 的 mＲ-NA 水平 較 正 常 皮 膚 表 達(dá) 增 高，為 正 常 對(duì) 照 組 的( 136. 82 ± 5. 58) % 。兩組TＲPV1 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( t = 28. 678，P ＜ 0. 05) 。
3. 2 免疫組化 見(jiàn)圖 2，表 1。對(duì) 22 份皮膚淀粉樣變患者皮損和 16 份正常對(duì)照皮膚標(biāo)本進(jìn)行了 TＲPV1 免疫組化染色分析，正常皮膚的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮中平滑肌細(xì)胞、汗腺、皮脂腺細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有TＲPV1 表達(dá)。TＲPV1 在正常皮膚呈低至中度表達(dá)在皮膚淀粉樣變皮損中呈高度表達(dá); 皮膚淀粉樣變皮損組與正常皮膚組 TＲPV1 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0. 05) 。
皮膚淀粉樣變是一種臨床上常見(jiàn)的淀粉樣蛋白沉積在皮膚內(nèi)的慢性炎癥性皮膚病，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩型，原發(fā)性皮膚淀粉樣變又分為常見(jiàn)的苔蘚樣、斑狀和少見(jiàn)的結(jié)節(jié)型皮膚淀粉樣變，目前本病的確切病因和發(fā)病機(jī)理仍未完全闡明。辣椒素受體( TＲPV1)是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道，TＲPV1 在皮膚組織的多種細(xì)胞上有表達(dá)，近期多篇研究報(bào)告提示 TＲPV1涉及皮膚生理和病理功能。
辣椒素受體作為一種非選擇性的陽(yáng)離子通道蛋白，廣泛分布于皮膚傳入神經(jīng)中的 C 纖維，激活此受體后可引起 Ca2 +、Mg2 +等離子內(nèi)流，并進(jìn)一步使C 類神經(jīng)纖維分泌 P 物質(zhì)( substance P，SP) 及降鈣素基因相關(guān)肽( CGＲP) ，而 P 物質(zhì)的釋放可驅(qū)動(dòng)肥大細(xì)胞釋放TNF-α、組胺、白三烯 B4、前列腺素，進(jìn)一步介導(dǎo)瘙癢反應(yīng)的發(fā)生，故辣椒素受體在瘙癢機(jī)制中起著重要作用。臨床上發(fā)現(xiàn) TＲPV1 的激動(dòng)劑辣椒素能治療慢性炎癥性皮膚病( 如銀屑病、皮膚瘙癢癥、結(jié)節(jié)性癢疹、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛等) ，但其機(jī)制不明。為探討 TＲPV1 在皮膚淀粉樣變皮損發(fā)病中的作用，我們選取臨床和病理確診的皮膚淀粉樣變患者的皮損，檢測(cè)皮損中 TＲ-PV1 的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在皮膚淀粉樣變皮損部位，TＲPV1 的 mＲNA表達(dá)水平和組化檢測(cè)的蛋白表達(dá)水平，較正常人皮膚明顯增高( P ＜ 0. 05) ，這
提示 TＲPV1 參與了皮膚淀粉樣變皮損的形成。
皮膚淀粉樣變?cè)谂R床上好發(fā)于中青年，中國(guó)、東南亞地區(qū)及南美洲高發(fā)，主要表現(xiàn)為淀粉樣蛋白在皮膚真皮乳頭的異常沉積，臨床常表現(xiàn)為褐色丘疹或結(jié)節(jié)，常伴劇烈瘙癢。而除家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變已找到致病基因外，其病因尚未明確，但部分研究人員推測(cè)有以下幾種可能性: ①角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡后形成早期階段的淀粉樣蛋白; ②EB 病毒感染后，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌淀粉樣物質(zhì); ③長(zhǎng)期瘙癢引起搔抓及摩擦，可刺激淀粉樣蛋白的沉積。目前，關(guān)于皮膚淀粉樣變及其瘙癢機(jī)制仍無(wú)較多的相關(guān)研究。瘙癢是皮膚淀粉樣變的主要癥狀，目前發(fā)現(xiàn)有特異的神經(jīng)傳導(dǎo)通路及介導(dǎo)瘙癢物質(zhì)參與瘙癢的發(fā)生。瘙癢的傳導(dǎo)通路，由外在或內(nèi)在介質(zhì)刺激瘙癢感受器( 真皮及表皮連接處的游離神經(jīng)末梢) 后，由 C 類神經(jīng)纖維傳導(dǎo)至背脊神經(jīng)根后上傳至大腦，大腦多區(qū)域同時(shí)發(fā)生興奮，產(chǎn)生癢覺(jué)并引起搔抓反應(yīng)。TＲPV1主要分布在 C 類神經(jīng)纖維，可被熱刺激、酸刺激及香草類化合物激活，C 類神經(jīng)纖維被激活后可使感覺(jué)神經(jīng)分泌顆粒內(nèi)的 P物質(zhì)及降鈣素基因相關(guān)肽( CGＲP) 等神經(jīng)肽釋放，而 P 物質(zhì)的釋放可驅(qū)動(dòng)肥大細(xì)胞釋放TNF-α、組胺、白三烯 B4、前列腺素，進(jìn)一步介導(dǎo)瘙癢反應(yīng)的發(fā)生。臨床上長(zhǎng)時(shí)間局部應(yīng)用 TＲPV1 激動(dòng)劑( 如 CAPSAICIN)，可逐漸使 C 纖維中的 P 物質(zhì)耗竭，減少肥大細(xì)胞脫顆粒后介導(dǎo)的一系列瘙癢反應(yīng)。
目前辣椒素受體在瘙癢性疾病中的研究主要為結(jié)節(jié)性癢疹及特應(yīng)性皮炎，但在皮膚淀粉樣變的研究在國(guó)內(nèi)外均為空白。在結(jié)節(jié)性癢疹研究中，部分研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子( NGF) 在結(jié)節(jié)性癢疹患者皮損區(qū)比正常皮膚表達(dá)明顯增多，而神經(jīng)表達(dá)的 NGF 上升，可使 TＲPV1 表達(dá)增加并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞增殖，降低機(jī)體對(duì)癢感的閾值，使介導(dǎo)瘙癢的受體表達(dá)上調(diào)，瘙癢介質(zhì)的生成增加及持久的炎癥反應(yīng)。Stander 等研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)節(jié)性癢疹的瘙癢性皮損，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和神經(jīng)纖維的 TＲPV1 表達(dá)顯著增加，外用辣椒素后表達(dá)恢復(fù)正常。對(duì)結(jié)節(jié)性癢疹患者外用辣椒素進(jìn)行治療，除可引起燒灼感及紅斑輕微不良反應(yīng)外，經(jīng)測(cè)試的患者皮損及瘙癢感均逐漸消退，但高使用頻率和停藥之后的高復(fù)發(fā)性，不便于臨床上大范圍使用。特應(yīng)性皮炎是一個(gè)慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)間的瘙癢，皮疹表現(xiàn)可以為紅斑、抓痕、苔蘚樣變、皮膚干燥，常伴有血清 IgE 的上升及家族過(guò)敏性鼻炎及哮喘史。在特應(yīng)性皮炎發(fā)展過(guò)程中，皮膚干燥及屏障功能下降與其發(fā)展有密切關(guān)系。Denda M 等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用 cap-sazepine( 抗辣椒堿，一種 TＲPV1 拮抗劑) 可加速皮膚屏障功能恢復(fù)，Yun 等［20，25］應(yīng)用 PAC-14028 ( TＲPV1拮抗 劑) ，能 有 效 降 低 由 塵 螨 提 取 粉 ( dermatopha-goides) 及惡唑酮( oxazolone) 在 NC / Nga 小鼠皮膚上所致的特應(yīng)性皮炎樣癥狀，PAC-14028 能加速膠帶撕貼試驗(yàn)后造成皮膚屏障功能破壞的修復(fù)。上述研究表明，TＲPV1 表達(dá)增加可能會(huì)增加瘙癢介質(zhì)的生成和加重炎癥反應(yīng)，而 TＲPV1 拮抗劑不但可以減輕特應(yīng)性皮炎癥狀，還可以促進(jìn)皮膚屏障功能恢復(fù)。
已有研究發(fā)現(xiàn)，在幾種不同的皮膚病中( 包括結(jié)節(jié)性癢疹、酒糟鼻、帶狀皰疹) ，表皮中的 TＲPV1 表達(dá)增高，這些研究證明 TＲPV1 與 這 些皮膚 病 的 發(fā) 生 有關(guān)［22，26-27］。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn) TＲPV1 在皮膚淀粉樣變中的表達(dá)高于正常皮膚，且表達(dá)于表皮全層，而正常皮膚 TＲPV1 均為低至中度表達(dá)，我們分析辣椒素受體在皮膚淀粉樣變皮損中表達(dá)升高，可能會(huì)增加瘙癢介質(zhì)的生成及加重炎癥反應(yīng)，造成患者長(zhǎng)期搔抓，進(jìn)一步誘發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌或形成淀粉樣蛋白，并加重皮膚淀粉樣變的發(fā)生及發(fā)展。但辣椒素受體是否為介導(dǎo)患者劇烈瘙癢的最主要原因，仍需進(jìn)一步研究辣椒素受體和其他瘙癢介質(zhì)、受體及炎癥因子在皮膚淀粉樣變中的作用機(jī)制。
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